比对结果过滤
过滤步骤将配置文件和每个 mate 的最终合并 BAM 文件作为输入，并使用以下命令执行 reads 配对并将其分配到限制片段（-s proc_hic）：
$HiC-Pro -c config-HiChIP.txt -i HiC_Pro/bowtie_results/bwt2 -o HiC_Pro -s proc_hic -s quality_checks
其中 -s quality_checks 保存与该第二步相关的统计和诊断图。
该命令在 hic_results/ 文件夹内生成一个 data/ 子文件夹，其中包含所有有效相互作用产物的坐标（.allValidPairs 文件）。
由于 HiC-Pro 执行配置文件中定义的所有过滤，因此可以使用一组修改后的过滤器重新运行过滤步骤。 首先，read pairs 根据其比对和配对情况进行过滤。 接下来，read pairs 被映射到限制片段上，并根据它们在限制片段上的位置和方向被分类为有效和无效 pairs。 然后，PCR 重复被移除，去重后的有效 pairs 被保存在 .allValidPairs 文件中。
如上表所总结的那样，在我们的数据集中，我们平均保留了约 28% 的测序 reads。
ChIP-Seq Peak Calling
为了用 hichipper 从 HiChIP 数据中准确鉴定相互作用区域，在可获得的情况下，提供来自 ChIP-Seq 实验的蛋白结合信息是有用的。
hichipper 将 ChIP-Seq peak 坐标以 BED 格式作为输入；我们将从 hESC 在 HS 处理前后 Rad21 ChIP-Seq 的原始 reads 开始生成此类文件。
在 fastq_ChIP 文件夹中下载 FASTQ 文件后，我们应用一个标准 pipeline，包括比对、转换为 BAM 格式、排序、去重复，最后进行 peak calling。
第一步是使用 bowtie 对 hg19 进行比对：
mkdir bowtie
mkdir ChIP_peaks
export BOWTIE_INDEXES=/home/Annotation/Homo_sapiens/UCSC/hg19/Sequence/BowtieIndex/
bowtie -S -t -p 16 -m 1 genome -1 fastq_ChIP/Rad21_1.fastq -2 fastq_ChIP/Rad21_2.fastq > bowtie/Rad21.sam
bowtie -S -t -p 16 -m 1 genome -1 fastq_ChIP/IgG_1.fastq -2 fastq_ChIP/IgG_2.fastq > bowtie/IgG.sam
接着，我们利用 samtools 进行 SAM 到 BAM 的转换，以及随后的排序和去重复：
samtools view -S -h -b bowtie/Rad21.sam -o bowtie/Rad21.bam
samtools view -S -h -b bowtie/IgG.sam -o bowtie/IgG.bam
samtools sort bowtie/Rad21.bam -o bowtie/Rad21.sort.bam
samtools sort bowtie/IgG.bam -o bowtie/IgG.sort.bam
samtools rmdup bowtie/Rad21.sort.bam bowtie/Rad21.sort.noDup.bam
samtools rmdup bowtie/IgG.sort.bam bowtie/IgG.sort.noDup.bam
rm bowtie/*.sam
rm bowtie/Rad21.bam
rm bowtie/IgG.bam
rm bowtie/*.sort.bam
最后，我们使用 MACS2 来Call ChIP-Seq peaks：
macs2 callpeak -t bowtie/Rad21.sort.noDup.bam -c bowtie/IgG.sort.noDup.bam --keep-dup all -g 2685511504 -n ChIP_peaks/Rad21
该命令将产生多个输出；对于 loop 的鉴定，我们需要 narrowPeak 文件（一种 BED 格式）。
最后，我们过滤 narrowPeak 文件，去除与 ENCODE blacklist 区域重叠的 peaks，通过以下命令生成最终的 Rad21_peaks.noBL.narrowPeak 文件：
intersectBed -a ChIP_peaks/Rad21_peaks.narrowPeak -b hg19_DAC_blacklist.bed -v > ChIP_peaks/Rad21_peaks.noBL.narrowPeak
我们分别在 untreated 和 HS 条件下获得 44,190 和 53,219 个显著的 Rad21 peaks。
